怎麼設計引物

❶ 怎麼設計中間引物

用軟體唄 Primer 5

❷ 如何讓設計引物

直接設計 只要包含了整個CDS區就可以

❸ 如何設計引物

引物設計是一小段單鏈DNA或RNA，在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發點而起作用的多核苷酸鏈。

❹ 怎樣設計目的基因的引物

首先 不管是前引物還是後引物，都得在設計引物時在5'端加一段保護序列（網上搜保護序列 有很多）
其次 在保護序列之後要加酶切位點（網上搜酶切位點）
然後 後引物還要加終止密碼子（3個隨便加）
最後 目的基因前後的序列按5'到3'的順序分別加在前後引物上

❺ 怎麼設計引物

PCR引物又稱為寡核苷酸引物，也就是RNA，是由人工合成的，PCR引物通常是一對，引物1和引物2。由於DNA聚合酶只能從核苷酸鏈的5'端到3'端進行復制，也就是只能識別3'的尾端，而且只能把核苷酸連到已經和DNA模板互補產生的多核苷酸鏈上，所以引物1和2分別於雙鏈DNA的兩條鏈的尾部（就是末尾是3'端的那一邊）結合，為那些脫氧核苷酸提供3'的末端，就相當於開了個頭。然後在DNA聚合酶的作用下合成兩條新鏈。而那段引物就成了新鏈的一部分。
其實在生物體內的DNA復制也是這樣的一個過程，只是引物是人體自身合成的
引物設計原則
* 序列選取應在基因的保守區段
* 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀發卡結構
* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
* Tm值在55－65℃（因為60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
* 引物之間的TM相差避免超過2℃
* 引物的3』端避免使用鹼基A，引物的3』端避免出現3個或3個以上連續相同的鹼基
* 為避免的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。
* Taqman探針技術要求片段長度在50bp－150bp
* 引物末端（最後5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。

❻ 怎樣設計PCR引物

引物設計需要注意的地方很多，在大多數情況下，我們都是在知道已知模板序列時進行PCR擴增的。
設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。引物分析軟體將試圖通過使用每一引物設計變化的預定值在這兩個目標間取得平衡。設計引用有一些需要注意的基本原理：
① 引物長度
一般引物長度為18~30鹼基。總的說來，決定引物退火溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長度。有以下公式可以用於粗略計算引物的退火溫度。
在引物長度小於20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物長度大於20bp時：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有許多軟體也可以對退火溫度進行計算，其計算原理會各有不同，因此有時計算出的數值可能會有少量差距。為了優化PCR反應，使用確保退火溫度不低於54℃的最短的引物可獲得最好的效率和特異性。

引物長度的上限並不很重要，主要與反應效率有關。由於熵的原因，引物越長，它退火結合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結合的穩定雙鏈模板的速率越小。

② GC含量
一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對引物的GC含量和Tm值應該協調。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5』端加適量的A、T或G、C尾巴。

③ 退火溫度
退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物鹼基數較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果鹼基數較多，那麼可以適當減低退火溫度，是DNA雙鏈結合。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響PCR的產率，但是理想情況下一對引物的退火
溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。

④ 避免擴增模板的二級結構區域
選擇擴增片段時最好避開模板的二級結構區域。用有關計算機軟體可以預測估計目的片段的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G）小於58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2』-脫氧GTP取代dGTP對擴增
的成功是有幫助的。

⑤ 與靶DNA的錯配
當被擴增的靶DNA序列較大的時候，一個引物就有可能與靶DNA的多個地方結合，造成結果中有多個條帶出現。這個時候有必要先使用BLAST軟體進行檢測，網址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

❼ 怎麼設計引物

選擇引物的一般規則
設計和選擇引物時有5個要素必需注意。
1 引物的3′末端不互補 引物的3′末端一定不能有很大的互補性，因為它們的互補會形成引物二聚體，這就會帶來很大的問題，例如合成出非專一的產物，極大地減少所期望產物的得量。有實驗表明，3′末端雙鏈的ΔG是0～－2 kcal/mol時，PCR產量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產量逐漸下降，在－6時只有40%，到－8時少於20%，而－10時，接近於0。雖然產量還取決於其他參數，如退火溫度、引物的專一性等等，但是用Taq聚合酶操作時，由於它的工作能力很強，能夠在很短的時間內就識別3′末端互補的雙鏈區並發動聚合反應，即使3′末端雙鏈的穩定性很差也不能阻礙它的作用，所以這時產量對二聚體的形成就有很大的依賴性。

2 引物分子內不互補 應當盡量不用會通過釋放能量而形成分子內雙鏈結構的寡核苷酸。雖然有些帶有發夾環，其ΔG為－3 kcal/mol的自身互補引物也可以得到不錯的結果，但是如果它的3′末端被發夾環占據時就很麻煩，即會引發引物內部的延伸反應，減少了參與正式反應引物的數量。當然，如果發夾環在5′末端對反應就沒有多大的影響了。

3 引物的組分、解鏈溫度和長度 普遍認為PCR引物應當有50%的GC/AT比率。其實，這是不對的。以人基因組DNA為模板，用81% AT的引物可以產生單一的，專一的，長250 bp，含有70% AT的產物。完全沒有必要復雜地去計算產物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應當等於或高於所要放大的模板的GC/AT比。要知道，更重要的因素是模板與穩定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因為DNA的解鏈溫度也取決於它的長度，所以有的研究者喜歡設計很長，而不求它很穩定的引物。可是，引物太長就難以避免形成二聚體和自身互補，因此，一般還是不用為好。如果期待的產物長度等於或小於500 bp，選用短的(16～18 mer)的引物：若產物長5 kb，則用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的產物。但是，引物較長時，如果不藉助引物選擇的計算機軟體幫助，就很難確定一對引物是否會形成二聚體，是否有自身互補性以及專一性如何。於是，用眼睛選出來的寡核苷酸放大長片段DNA時就會使引物彼此引發而不是延伸模板，得出非專一產物。
4 引物的內部穩定性 在DNA測序和PCR中最好用5′末端穩定(如GC含量較多)，而3′末端不太穩定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發反應。這就是基於引物內部穩定性的經驗之談。其3′末端穩定性低的引物在這些反應中能起好作用的原因在於，接近或在3′末端上的鹼基與非靶位點鹼基所形成的配對的穩定程度還不足以引發DNA合成，所以不會產生假產物。因此，為了有效地引發反應，引物的5′末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩定的、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對，只憑借其3′末端與靶序列任何位點的牢固配合就可以引發反應，產生非專一產物。如果用3′末端低穩定性的引物，反應的最適退火溫度范圍會不尋常的寬。這就可以不經過事先的最佳化實驗就能在最佳條件下進行反應。還要注意的是PCR反應產物的質量還取決於模板(底物的復雜性、Tm、產物長度)和退火的溫度與時間。所以，有時3′末端穩定的引物也可以滿意地進行反應。但是，無論如何，寡核苷酸3′末端最後5個核苷酸的穩定性小於－9 kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3′末端越不穩定，假引發的可能性越低。

5 引物的唯一性 為了放大單個的、專一性DNA片段，選用的引物序列就應當是唯一的，即在模板中沒有重復序列。雖然不會整個引物序列都偏好於和模板中的一個以上位點匹配，但是，通常見到的引物的3′末端往往都有6～7個沒有什麼個性的核苷酸。如果假引發的位點正好在放大區的內部，那麻煩就大了。由於短的DNA片段有更高的PCR或雜交效率，就容易產生非專一產物。如果用哺乳動物基因組序列作為模板，可以用Alu序列或其他短重復元件來核對想用的引物的互補性。由此也可知，應當避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重復(如—ATATAT—)。

❽ 怎樣設計引物

一般是通過設計軟體，例如oligo6，primer5等，你可以在網上搜一下引物設計軟體下載和使用說明，是比版較容易權的。
至於設計引物的一般原則如下：
* 序列選取應在基因的保守區段
* 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀發卡結構
* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
* Tm值在55－65℃（因為60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
* 引物之間的TM相差避免超過2℃
* 引物的3』端避免使用鹼基A，引物的3』端避免出現3個或3個以上連續相同的鹼基
* 為避免的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。
* Taqman探針PCR要求片段長度在80bp－150bp
* 引物末端（最後5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。

❾ PCR引物設計怎麼做 啊跪求！

PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優劣直接關繫到PCR的特異性與成功與否。
要設計引物首先要找到DNA序列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。
現在可以在這一保守區域里設計一對引物。一般引物長度為15~30鹼基，擴增片段長度為100~600鹼基對。
讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種鹼基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設計的就不合理。應重新尋找區域設計引物。

同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應多於4個連續鹼基的互補。

引物確定以後，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點序列；標記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3′端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3′端開始的。這里還需提醒的是3′端不要終止於密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發生簡並，會影響擴增的特異性與效率。

綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設計原則：

① 引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。
② 產物不能形成二級結構。
③ 引物長度一般在15~30鹼基之間。
④ G+C含量在40%~60%之間。
⑤ 鹼基要隨機分布。
⑥ 引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
⑦ 引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
⑧ 引物5′端可以修飾。
⑨ 引物3′端不可修飾。
⑩ 引物3′端要避開密碼子的第3位。

PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優劣直接關繫到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助於引物的設計。

1.引物的特異性

引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補鹼基同源。

2.避開產物的二級結構區

某些引物無效的主要原因是引物重復區DNA二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關計算機軟體可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小於58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。

3.長度

寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大於38，因為>38時，最適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產物的特異性。

4.G+C含量

G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高於Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。

5.鹼基礎隨機分布

引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。

6.引物自身

引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾狀結構牙引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補鹼基不能大於3bp。

7.引物之間

兩引物之間不應不互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多於4個連續鹼基的同源性或互補性。

8.引物的3′端

引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應中，引物3′端不能發生錯配。

在標准PCR反應體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環參數擴增HIV-1 gag基因區的條件下，引物3′端錯配對擴增產物的影響是有一定規律的。A∶A錯配使產量下降至1/20，A∶G和C∶C錯七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。

9.引物的5′端

引物的5′端限定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。

10.密碼子的簡並

如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡並，會影響擴增特異性與效率。

特殊目的的引物設計將在有關章節討論。隨著人們對引物的認識，一些引物的計算機設計程序也應運而生，下面將討論有關引物計算機設計方法。

現有的引物設計軟體有primer5.0比較好。

❿ 怎麼設計擴全長的引物

您應該使用巢式PCR來做這個實驗。

無論您是先提RNA再做反轉錄，還是直接從DNA中獲得基因，考慮到模板的復雜性，都應當使用巢式PCR。建議您先從目的基因的上下游設計一段引物，即外引物，再根據目的基因上下游設計一段內引物。

外引物不在目的基因上，可以在目的基因上下游100bp以內，這就可以利用引物設計找出最優秀的引物，提高了第一次PCR的成功率。將第一次PCR產物做模板，進行第二次PCR，這樣如果P出了大小正確的條帶，就可以肯定是你的目的條帶。因為兩次特異性擴增再加上大小正確，這樣的總特異性是極高的。

另外，由於在第二次PCR過程中，模板是第一次PCR產物，成分單一，就是內引物再糟糕，也沒有問題，這就規避了你提到的「那如果在CDS區兩端設計不出引物怎麼辦？」這個問題。

您明白了嗎？歡迎追問！