引物的設計

㈠ PCR的引物怎樣設計

PCR引物又稱為寡核苷酸引物，也就是RNA，是由人工合成的，PCR引物通常是一對，引物1和引物2。由於DNA聚合酶只能從核苷酸鏈的5'端到3'端進行復制，也就是只能識別3'的尾端，而且只能把核苷酸連到已經和DNA模板互補產生的多核苷酸鏈上，所以引物1和2分別於雙鏈DNA的兩條鏈的尾部（就是末尾是3'端的那一邊）結合，為那些脫氧核苷酸提供3'的末端，就相當於開了個頭。然後在DNA聚合酶的作用下合成兩條新鏈。而那段引物就成了新鏈的一部分。
其實在生物體內的DNA復制也是這樣的一個過程，只是引物是人體自身合成的
引物設計原則
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序列選取應在基因的保守區段
*
避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀發卡結構
*
典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
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Tm值在55－65℃（因為60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
*
引物之間的TM相差避免超過2℃
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引物的3』端避免使用鹼基A，引物的3』端避免出現3個或3個以上連續相同的鹼基
*
為避免的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。
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Taqman探針技術要求片段長度在50bp－150bp
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引物末端（最後5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。

㈡ 引物設計

NoePrimer：獨一無二的引物設計工作站

NoePrimer是獨特的引物設計軟體，它可以把繁雜的引物設計過程簡單化，滿足您復雜而專業的設計需要。

NoePrimer為引物設計提供了簡單的、直觀的、圖形化的模板和引物序列展示。它不但能進行常規PCR引物、雜交探針和測序引物的設計，同時，它還能進行多重PCR引物分析以及高通量的引物搜索和查找功能。

NoePrimer的與眾不同之處在於:
1.界面清晰、方便友好且擁有豐富的序列信息。
2.易學易用。只需要簡單的按幾個按鈕或自動搜索就可以設計您需要的引物。
3.直觀的圖形化展示PCR產物、發夾結構、引物二聚體和錯配，方便您的分析。
4.設計和搜索多重引物，包括PCR引物、序列探針和測序引物。並具有高通量的多序列引物搜索功能。
5.靈活而強大的參數設置，包括添加接頭和查找與已經存在的引物相配的引物。
6.跟蹤引物。可以輕易的把引物保存於引物庫中，並可以訂購所選的引物。
7.整合圖形化序列特徵，進一步協助您設計引物。
8.實行中英文界面互換

㈢ 怎麼設計引物

PCR引物又稱為寡核苷酸引物，也就是RNA，是由人工合成的，PCR引物通常是一對，引物1和引物2。由於DNA聚合酶只能從核苷酸鏈的5'端到3'端進行復制，也就是只能識別3'的尾端，而且只能把核苷酸連到已經和DNA模板互補產生的多核苷酸鏈上，所以引物1和2分別於雙鏈DNA的兩條鏈的尾部（就是末尾是3'端的那一邊）結合，為那些脫氧核苷酸提供3'的末端，就相當於開了個頭。然後在DNA聚合酶的作用下合成兩條新鏈。而那段引物就成了新鏈的一部分。
其實在生物體內的DNA復制也是這樣的一個過程，只是引物是人體自身合成的
引物設計原則
* 序列選取應在基因的保守區段
* 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀發卡結構
* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
* Tm值在55－65℃（因為60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
* 引物之間的TM相差避免超過2℃
* 引物的3』端避免使用鹼基A，引物的3』端避免出現3個或3個以上連續相同的鹼基
* 為避免的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。
* Taqman探針技術要求片段長度在50bp－150bp
* 引物末端（最後5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。

㈣ 怎樣設計引物

一般是通過設計軟體，例如oligo6，primer5等，你可以在網上搜一下引物設計軟體下載和使用說明，是比版較容易權的。
至於設計引物的一般原則如下：
* 序列選取應在基因的保守區段
* 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀發卡結構
* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
* Tm值在55－65℃（因為60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
* 引物之間的TM相差避免超過2℃
* 引物的3』端避免使用鹼基A，引物的3』端避免出現3個或3個以上連續相同的鹼基
* 為避免的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。
* Taqman探針PCR要求片段長度在80bp－150bp
* 引物末端（最後5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。

㈤ 「引物」設計的原則是什麼

引物設計有 3 條基本原則：

• 引物與模板的序列要緊密互補。

• 引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構。

• 再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。

㈥ 如何設計引物

引物設計是一小段單鏈DNA或RNA，在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發點而起作用的多核苷酸鏈。

㈦ 引物設計時為什麼要設計兩個他們兩個是什麼關系

引物 (primer)
引物，是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始點，存在於自然中生物的DNA復制（內RNA引物）和聚合酶鏈容式反應(PCR)中人工合成的引物（通常為DNA引物）。引物（DNA，RNA的） primer 指在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的。
引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區域另一端的另一條DNA模板鏈互補。
在PCR（聚合酶鏈式反應）技術中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據這一序列合成引物，利用PCR擴增技術，
引物的結合目的基因DNA受熱變性後解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，然後在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重復循環，延伸後得到的產物同樣可以和引物結合。

㈧ 怎麼設計引物

選擇引物的一般規則
設計和選擇引物時有5個要素必需注意。
1 引物的3′末端不互補 引物的3′末端一定不能有很大的互補性，因為它們的互補會形成引物二聚體，這就會帶來很大的問題，例如合成出非專一的產物，極大地減少所期望產物的得量。有實驗表明，3′末端雙鏈的ΔG是0～－2 kcal/mol時，PCR產量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產量逐漸下降，在－6時只有40%，到－8時少於20%，而－10時，接近於0。雖然產量還取決於其他參數，如退火溫度、引物的專一性等等，但是用Taq聚合酶操作時，由於它的工作能力很強，能夠在很短的時間內就識別3′末端互補的雙鏈區並發動聚合反應，即使3′末端雙鏈的穩定性很差也不能阻礙它的作用，所以這時產量對二聚體的形成就有很大的依賴性。

2 引物分子內不互補 應當盡量不用會通過釋放能量而形成分子內雙鏈結構的寡核苷酸。雖然有些帶有發夾環，其ΔG為－3 kcal/mol的自身互補引物也可以得到不錯的結果，但是如果它的3′末端被發夾環占據時就很麻煩，即會引發引物內部的延伸反應，減少了參與正式反應引物的數量。當然，如果發夾環在5′末端對反應就沒有多大的影響了。

3 引物的組分、解鏈溫度和長度 普遍認為PCR引物應當有50%的GC/AT比率。其實，這是不對的。以人基因組DNA為模板，用81% AT的引物可以產生單一的，專一的，長250 bp，含有70% AT的產物。完全沒有必要復雜地去計算產物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應當等於或高於所要放大的模板的GC/AT比。要知道，更重要的因素是模板與穩定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因為DNA的解鏈溫度也取決於它的長度，所以有的研究者喜歡設計很長，而不求它很穩定的引物。可是，引物太長就難以避免形成二聚體和自身互補，因此，一般還是不用為好。如果期待的產物長度等於或小於500 bp，選用短的(16～18 mer)的引物：若產物長5 kb，則用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的產物。但是，引物較長時，如果不藉助引物選擇的計算機軟體幫助，就很難確定一對引物是否會形成二聚體，是否有自身互補性以及專一性如何。於是，用眼睛選出來的寡核苷酸放大長片段DNA時就會使引物彼此引發而不是延伸模板，得出非專一產物。
4 引物的內部穩定性 在DNA測序和PCR中最好用5′末端穩定(如GC含量較多)，而3′末端不太穩定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發反應。這就是基於引物內部穩定性的經驗之談。其3′末端穩定性低的引物在這些反應中能起好作用的原因在於，接近或在3′末端上的鹼基與非靶位點鹼基所形成的配對的穩定程度還不足以引發DNA合成，所以不會產生假產物。因此，為了有效地引發反應，引物的5′末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩定的、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對，只憑借其3′末端與靶序列任何位點的牢固配合就可以引發反應，產生非專一產物。如果用3′末端低穩定性的引物，反應的最適退火溫度范圍會不尋常的寬。這就可以不經過事先的最佳化實驗就能在最佳條件下進行反應。還要注意的是PCR反應產物的質量還取決於模板(底物的復雜性、Tm、產物長度)和退火的溫度與時間。所以，有時3′末端穩定的引物也可以滿意地進行反應。但是，無論如何，寡核苷酸3′末端最後5個核苷酸的穩定性小於－9 kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3′末端越不穩定，假引發的可能性越低。

5 引物的唯一性 為了放大單個的、專一性DNA片段，選用的引物序列就應當是唯一的，即在模板中沒有重復序列。雖然不會整個引物序列都偏好於和模板中的一個以上位點匹配，但是，通常見到的引物的3′末端往往都有6～7個沒有什麼個性的核苷酸。如果假引發的位點正好在放大區的內部，那麻煩就大了。由於短的DNA片段有更高的PCR或雜交效率，就容易產生非專一產物。如果用哺乳動物基因組序列作為模板，可以用Alu序列或其他短重復元件來核對想用的引物的互補性。由此也可知，應當避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重復(如—ATATAT—)。

㈨ 簡述引物設計的基本原則

1.PCR技術基本原理：PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 2.PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引 物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。 3.PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。 4.PCR的特點：特異性強。對標本的純度要求低。靈敏度高。 5.PCR反應的特異性決定因素為： ①引物與模板DNA特異正確的結合； ②鹼基配對原則； ③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性； ④靶基因的特異性與保守性。