sirna设计

❶ 在invitrogen上设计得到的siRNA只有一条，是从5端到3端的吧，公司合成时会按双链合成的

看你自己设计时候的选项。如果选的是发夹结构，虽然是单链，但是自己会形成发夹双链结构，如果是很短的（20bp），则是单链

❷ 设计sirna时19个碱基和21个碱基的区别

抑制剂与rna干扰哪个效果更好
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是通过抑制转录后水平的基因表达而诱导功能缺失表型的有力工具。由dsRNA（double-stranded RNA）引发的特定基因表达受抑制现象称为RNA干扰作用。

dsRNA（double-stranded RNA）可以介导基因沉默作用，以dsRNA为基点研究基因沉默的分子机制成为热点。dsRNA指的是大于30个碱基对的RNA分子。哺乳动物细胞有至少2条路径竞争双链RNA(dsRNA)，其一是特异性路径：特殊dsRNA的序列用于RNAi，起始阶段dsRNA被切成siRNA（small interfering RNA 或short interfering RNAs）。siRNA是RNA干扰作用赖以发生的重要中间效应分子，能提供一定的信息，允许一个特定的mRNA被降解。siRNA正义链与反义链各有21个碱基，其中19个碱基配对，再每条链的3’端都有2个不配对的碱基。
另一条是非特异性路径：只要有长的dsRNA的存在它可以降解所有的RNA，抑制所有蛋白质的合成。长的dsRNA激活蛋白激酶PKR，激活的PKR通过一系列的磷酸化关闭翻译起始因子，导致翻译抑制。也可以通过激活2’－5’AS 合成一个分子激活RNase L，导致非特异的RNA降解。
关于特异性的RNA作用机制模型，包括起始阶段和效应阶段。起始阶段dsRNA在Dicer酶（RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，属内切核酸酶）的作用下加工裂解21－23核甘酸长的小分子干扰RNA片断（siRNA）。Dicer含有解旋酶活性以及dsRNA结合域和PAZ结构。
在RNAi 的效应阶段，siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白/RNA复合物（RNA－inced silencing complex or RISC），在siRNA 解双链即RISC激活过程需一个ATP。由RISC中siRNA反义链与mRNA互补区域结合，随后切割mRNA从而达到在RNA水平干扰基因表达。RISC由多种蛋白成分组成，包括核酸酶，解旋酶和同源RNA链搜索活性等。

❸ 如何设计有效的siRNA

1.化学合成

尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究

不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素

2.体外转录

通过体外转录的方法可以合成siRNAs，这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。以Silencer
siRNA Construction Kit为例，一旦得到DNA
Oligo模版（这个还是需要DNA合成的，不过DNA合成的成本就比较低了），只要24小时就可以，不需要等很久。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间——毕竟，化学合成只需要定购就可以了。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果（0.5-20nM
vs. 50-100 nM per transfection ）

最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。

不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。

❹ SiRNA设计后BLAST同其他基因组有部分匹配有关系吗

Blast（Basic Local Alignment Search Tool）是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。BLAST结果中的得分是对一种对相似性的统计说明。 BLAST 采用一种局部的算法获得两个序列中具有相似性的序列。 Blast中常用的程序介绍： 1、BLASTP是蛋白序列到蛋白库中的一种查询。库中存在的每条已知序列将逐一地同每条所查序列作一对一的序列比对。 2、BLASTX是核酸序列到蛋白库中的一种查询。先将核酸序列翻译成蛋白序列（一条核酸序列会被翻译成可能的六条蛋白），再对每一条作一对一的蛋白序列比对。 3、BLASTN是核酸序列到核酸库中的一种查询。库中存在的每条已知序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对。 4、TBLASTN是蛋白序列到核酸库中的一种查询。与BLASTX相反，它是将库中的核酸序列翻译成蛋白序列，再同所查序列作蛋白与蛋白的比对。 5、TBLASTX是核酸序列到核酸库中的一种查询。此种查询将库中的核酸序列和所查的核酸序列都翻译成蛋白（每条核酸序列会产生6条可能的蛋白序列），这样每次比对会产生36种比对阵列。

❺ siRNA转染实验

1.设计合成有效的siRNA
RNAi的核心需要siRNA对相应mRNA进行有效的结合和作用。siRNA的设计合成首先很重要，最优的设计可以用最小的工作浓度取得满意的沉

默效果，减少副反应的发生。siRNA的设计可以通过检索,优先选用经过验证的siRNA或设计多对siRNA。需要强调的是，需要同时设置阴性对照以排
除非特异沉默现象和阳性对照以确认整个实验体系的有效性。
2.合成的siRNA注意纯度和工作浓度
siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA，siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。siRNA的工作浓度和siRNA的设计、细胞种类、目标基因有关。建议一定进行相关的预实验优化各条件。
3.选择合适的siRNA转染试剂
选择合适的siRNA转染试剂是的RNAi实验成功另一个关键。由于细胞毒性对siRNA实

验的影响非常大，可以直接影响实验结论和结果，所以一定选择低毒性的转染试剂，看一个转染试剂毒性是否低，有一个简单的方法，看转染的过程和要求，比如要

求的细胞密度越大，说明毒性越大，比如转染复合物容许和细胞孵育的时间越短，说明毒性越大。除了低毒性，还最好操作简便，越简单越好，比如有的转染试剂要

求转染前换无血清培养基或低血清培养基，转染后又要有血清培养基，实际上，由于培养条件的频繁变化，可能会对细胞表达模式产生影响，对后续的mRNA和蛋
白分析也同样产生影响，最终影响实验的可靠性。

❻ 筛选的sirna可以直接用于设计shrna吗

siRNA 基因沉默子进入来培养细胞，可快速自有效地短暂地降低靶基因的表达。使用嘌呤酶素选择 shRNA 或 shRNA 慢病毒颗粒是一种达到稳定基因沉默的方法。因此，如果一个靶基因的蛋白转换较慢，shRNA 质粒或 shRNA 慢病毒颗粒应该是达到同样效果的理想...

❼ siRNA有哪些设计

以前人们一般应用较长的dsRNA作为基因沉默的工具，但后来发现长链dsRNA特异性较差。它不仅可激活RnaseL，导致非特异性RNA降解，而且还能激活依赖于dsRNA的蛋白激酶R（protein：kinase：R，PKR），PKR可磷酸化翻译起始因子e：IF2并使其失活，从而抑制翻译起始。后来人们发现小于30bp的dsRNA即可有效引起基因沉默，并且不会产生非特异抑制现象，进一步研究表明抑制作用最强的是长21bp、3′端有两个碱基突出的siRNA。

但RNAi技术要求siRNA反义链与靶基因序列之间严格的碱基配对，单个碱基错配就会大大降低沉默效应，而且siRNA还可以造成与其具同源性的其他基因沉默（也叫交叉沉默），所以在siRNA的设计中序列问题是至关重要的。要求所设计的siRNA只能与靶基因具高度同源性而尽可能少的与其他基因同源。

设计siRNA序列应注意以下几点：①从靶基因转录本（mRNA）起始密码子AUG开始，向下游寻找AA双核苷酸序列，将此双核苷酸序列和其下游相邻19个核苷酸序列作为siRNA序列设计模板，有研究结果显示GC含量在45%55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效；

②每个基因选择45个siRNA序列，然后运用生物信息学方法进行同源性比较，例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.govBLAST），剔除与其他基因或EST序列有同源性的序列，选出一个特异性最强的siRNA进行合成；

③尽量不要以mRNA的5′端和3′端非翻译区及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，因为这些区域有许多调节蛋白结合位点（如翻译起始复合物），调节蛋白会与RISC竞争结合靶序列，降低siRNA的基因沉默效应。

❽ 怎么在NCBI上查到11-β HSD1的mRNA序列，怎么设计siRNA来做RNA干扰沉默该基因呢

很基础的问题啊，在NCBI上search：gene,下面的对话框输入你要找的基因的名称，会出专来相关的基因序列，看你要属找什么物种的，一般是人和鼠的，如人的后缀是Homo sapiens，鼠的是Mus musculus。点击你要的序列号，会进入这个基因的基本信息，一直往下拉会看到mRNA and Protein(s) ，NM开头的序列号就是其CDNA的序列了。关于SiRNA，需要去网站搜索，如invitrogen,promega,等大型生物网站都有相关的tools给你设计，很方便！http://jura.wi.mit.e/bioc/siRNAext/siRNA_search.cgi?tasto=10925811，你去试试吧

❾ 知不知道有哪些在线设计siRNA的网址

发物种，基因名至@ribobio.com即可
On-line tools for designing RNAi probes Design tool
Reference
-->Ambion siRNA Target Finder Elbashir SM, Harborth J et al.
-->Dharmacon siDesign Reynolds A, Leake D et al.
-->Clontech siRNA designer Elbashir SM, Lendeckel W et al.
-->DEQOR Henschel A, Buchholz F et al. EMBOSS SIRNA Elbashir SM, Harborth J et al. siRNA design Yiu SM, Wong PW et al. https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai Wang L, Mu FY.
-->IDT siRNA design Parrish S, Fleenor J et al. Elbashir SM, Harborth J et al.
-->Interagon Saetrom P.
-->siRNA at Whitehead Yuan B, Latek R et al. Invitrogen BLOCK-iT(tm)
-->T7 RNAi Oligo Designer Dudek P, Picard D. siDirect Naito Y, Yamada T et al. siSearch Chalk AM, Wahlestedt C et al.