引物的设计

㈠ PCR的引物怎样设计

PCR引物又称为寡核苷酸引物，也就是RNA，是由人工合成的，PCR引物通常是一对，引物1和引物2。由于DNA聚合酶只能从核苷酸链的5'端到3'端进行复制，也就是只能识别3'的尾端，而且只能把核苷酸连到已经和DNA模板互补产生的多核苷酸链上，所以引物1和2分别于双链DNA的两条链的尾部（就是末尾是3'端的那一边）结合，为那些脱氧核苷酸提供3'的末端，就相当于开了个头。然后在DNA聚合酶的作用下合成两条新链。而那段引物就成了新链的一部分。
其实在生物体内的DNA复制也是这样的一个过程，只是引物是人体自身合成的
引物设计原则
*
序列选取应在基因的保守区段
*
避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构
*
典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
*
Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
*
引物之间的TM相差避免超过2℃
*
引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
*
为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
*
Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp
*
引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

㈡ 引物设计

NoePrimer：独一无二的引物设计工作站

NoePrimer是独特的引物设计软件，它可以把繁杂的引物设计过程简单化，满足您复杂而专业的设计需要。

NoePrimer为引物设计提供了简单的、直观的、图形化的模板和引物序列展示。它不但能进行常规PCR引物、杂交探针和测序引物的设计，同时，它还能进行多重PCR引物分析以及高通量的引物搜索和查找功能。

NoePrimer的与众不同之处在于:
1.界面清晰、方便友好且拥有丰富的序列信息。
2.易学易用。只需要简单的按几个按钮或自动搜索就可以设计您需要的引物。
3.直观的图形化展示PCR产物、发夹结构、引物二聚体和错配，方便您的分析。
4.设计和搜索多重引物，包括PCR引物、序列探针和测序引物。并具有高通量的多序列引物搜索功能。
5.灵活而强大的参数设置，包括添加接头和查找与已经存在的引物相配的引物。
6.跟踪引物。可以轻易的把引物保存于引物库中，并可以订购所选的引物。
7.整合图形化序列特征，进一步协助您设计引物。
8.实行中英文界面互换

㈢ 怎么设计引物

PCR引物又称为寡核苷酸引物，也就是RNA，是由人工合成的，PCR引物通常是一对，引物1和引物2。由于DNA聚合酶只能从核苷酸链的5'端到3'端进行复制，也就是只能识别3'的尾端，而且只能把核苷酸连到已经和DNA模板互补产生的多核苷酸链上，所以引物1和2分别于双链DNA的两条链的尾部（就是末尾是3'端的那一边）结合，为那些脱氧核苷酸提供3'的末端，就相当于开了个头。然后在DNA聚合酶的作用下合成两条新链。而那段引物就成了新链的一部分。
其实在生物体内的DNA复制也是这样的一个过程，只是引物是人体自身合成的
引物设计原则
* 序列选取应在基因的保守区段
* 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
* Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
* 引物之间的TM相差避免超过2℃
* 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
* 为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
* Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp
* 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

㈣ 怎样设计引物

一般是通过设计软件，例如oligo6，primer5等，你可以在网上搜一下引物设计软件下载和使用说明，是比版较容易权的。
至于设计引物的一般原则如下：
* 序列选取应在基因的保守区段
* 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
* Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
* 引物之间的TM相差避免超过2℃
* 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
* 为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
* Taqman探针PCR要求片段长度在80bp－150bp
* 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

㈤ “引物”设计的原则是什么

引物设计有 3 条基本原则：

• 引物与模板的序列要紧密互补。

• 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。

• 再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

㈥ 如何设计引物

引物设计是一小段单链DNA或RNA，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。

㈦ 引物设计时为什么要设计两个他们两个是什么关系

引物 (primer)
引物，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，存在于自然中生物的DNA复制（内RNA引物）和聚合酶链容式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为DNA引物）。引物（DNA，RNA的） primer 指在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。
在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，
引物的结合目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

㈧ 怎么设计引物

选择引物的一般规则
设计和选择引物时有5个要素必需注意。
1 引物的3′末端不互补 引物的3′末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物的得量。有实验表明，3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%，到－8时少于20%，而－10时，接近于0。虽然产量还取决于其他参数，如退火温度、引物的专一性等等，但是用Taq聚合酶操作时，由于它的工作能力很强，能够在很短的时间内就识别3′末端互补的双链区并发动聚合反应，即使3′末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用，所以这时产量对二聚体的形成就有很大的依赖性。

2 引物分子内不互补 应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的寡核苷酸。虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。

3 引物的组分、解链温度和长度 普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率。其实，这是不对的。以人基因组DNA为模板，用81% AT的引物可以产生单一的，专一的，长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR的效率越高。因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的产物。但是，引物较长时，如果不借助引物选择的计算机软件帮助，就很难确定一对引物是否会形成二聚体，是否有自身互补性以及专一性如何。于是，用眼睛选出来的寡核苷酸放大长片段DNA时就会使引物彼此引发而不是延伸模板，得出非专一产物。
4 引物的内部稳定性 在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。还要注意的是PCR反应产物的质量还取决于模板(底物的复杂性、Tm、产物长度)和退火的温度与时间。所以，有时3′末端稳定的引物也可以满意地进行反应。但是，无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。

5 引物的唯一性 为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列。虽然不会整个引物序列都偏好于和模板中的一个以上位点匹配，但是，通常见到的引物的3′末端往往都有6～7个没有什么个性的核苷酸。如果假引发的位点正好在放大区的内部，那麻烦就大了。由于短的DNA片段有更高的PCR或杂交效率，就容易产生非专一产物。如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。由此也可知，应当避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重复(如—ATATAT—)。

㈨ 简述引物设计的基本原则

1.PCR技术基本原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 2.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 3.PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 4.PCR的特点：特异性强。对标本的纯度要求低。灵敏度高。 5.PCR反应的特异性决定因素为： ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。